To summarize, for high imaging resolution a high numerical aperture objective is required and one of the consequences of that is a fairly small depth of field which places an emphasis on the quality and performance of your focusing stage and XY sample positioning stage. Dover Motion has developed the DOF-5 specifically for microscope objective focusing.

When it comes to digital imaging sensors, there is a wide variety to choose from. The main camera sensors used are CCD (charge-coupled device) or CMOS, Complementary Metal Oxide Semiconductor. For cutting edge performance, to reduce read noise, large and expensive cameras exist with liquid or Peltier coolers (deep cooled to about -60 degrees Celsius). Also, EMCCD (Electron Multiplied CCD) cameras allow for single photon detection and are popular for live cell imaging applications. Learn more about key aspects of image sensors common to both CCD and CMOS devices, starting at the pixel level in our "CCD Image Sensors" whitepaper.

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Covers key formulas for selecting the optimal imaging sensor and microscope objective for your digital imaging application including sensor size, magnification, field of view, pixel sizes, resolution, depth of field, and numerical aperture.

The sample is throwing light out in all directions and the job of the objective is to collect as much of that light as possible. The way to do that is to have a high numerical aperture, a big wide cone. If the objective doesn’t collect a wide-angle of the cone, for example, a long working distance, low power objective will merely be getting the light that’s going straight through. That is why numerical aperture is the key to high-resolution imaging. There is one other variable that can be adjusted. By using bluer light, the resolution can be increased, but for a particular application, that may not be possible. Generally speaking, for any given objective, it is worth it to pay to get the highest possible numerical aperture, but there is a slight downside to that.

Dazu ein Beispiel: Bei 50mm Brennweite wird ein Abbildungsmaßstab von 1:1 ungefähr bei einer Motiv-Entfernung von 19cm erreicht, bei 70mm sind es etwa 25cm und bei 100mm sogar 30cm. Alle Angaben gelten wohlgemerkt für den Abstand „Motiv bis Sensor“ und nicht „Motiv bis Frontlinse“.

The same thing occurs in traditional photography, a very small aperture will increase the depth of field. A higher numerical aperture will give a higher resolution, but the depth of field becomes considerably smaller. There is a distance above the sample plane and a distance below the sample plane, and anywhere within them, there is essentially perfect focus. As soon as the objective and sample are outside of that boundary, the image begins to blur.

For a low power 4x system, the numerical aperture is going to be very low, on the order of 0.05 to 0.1. In a medium power 40x system, it could be in the range of 0.5 to 0.8 and for a high power system, it can be as high as 0.9 or 0.95. As long as there is air between the objective and the sample, the numerical aperture can never exceed 1. When imaging slides, in order to exceed an NA of 1, a liquid can be added between the coverslip and the objective. Typically, oil or water are used for this and the objectives are referred to as oil immersion or water immersion objectives. With water, the numerical aperture goes up to about 1.1 and using oil, the numerical aperture can go up to as high as 1.47.

Der Abbildungsmaßstab eines Objektivs ist fast in jedem Datenblatt zu finden und informiert über die Abbildungsgröße eines Motivs auf dem Sensor. Bei einem Abbildungsmaßstab von 1:1 (alternative Schreibweise 1,0) wird ein 36 x 24mm großes Objekt bildfüllend, also 36 x 24mm groß, auf dem Sensor abgebildet. Bei einem Abbildungsmaßstab von 1:2 würde die Darstellung mit 18 x 12mm erfolgen. Wie man hieran sieht, ist die Abbildungsgröße auch von der Sensorgröße der verwendeten Kamera abhängig. Je kleiner der Sensor ausfällt, desto größer ist auch der „effektive“ kleinbildäquivalente Abbildungsmaßstab. Der Abbildungsmaßstab des Objektivs ändert sich allerdings nicht, nur der Bildeindruck. Die Umrechnung des kleinbildäquivalenten Abbildungsmaßstabes lässt sich dabei genauso wie die Berechnung der kleinbildäquivalenten Brennweite vornehmen.

Der Abstand vom Motiv ist aber noch aus einem anderen Grund relevant: wegen der Beleuchtung. Bei der Makrofotografie wird teilweise sehr viel Licht benötigt, kurze Aufnahmeabstände sind daher nicht immer sinnvoll. Ein größerer Motivabstand lässt oftmals mehr Licht auf das Motiv fallen oder verhindert Abschattungen durch das Objektiv, die Kamera oder den Fotografen. Die Beleuchtungsproblematik lässt sich zwar mit speziellen Lampen (z. B. einem Ringlicht) oder auch Blitzen (z. B. einem Zangenblitz) lösen, ein größer Motivabstand ist jedoch meistens nicht von Nachteil.

A larger field of view is generally desirable, as it allows for a larger area of the sample to be viewed at once, making it easier to locate and navigate to specific areas of interest. However, as the magnification increases, the field of view decreases, making it more difficult to observe larger areas of the specimen at higher magnifications. Need help with microscope calculations? Download our calculator.

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Wird ein Objektiv mit einem Abbildungsmaßstab von 1:1 an einer Kamera mit MFT-Sensor genutzt, ergibt sich also ein kleinbildäquivalenter Abbildungsmaßstab von 2:1.

Besides the magnification, reducing the size of the sensor down to the size of the field of view on the sample also does the same with the pixels. For example, a sensor with 4 micron pixels and a 40X objective would be 0.1 micron of geometric resolution or 100 nanometers. But it turns out it isn’t quite that simple. There’s a property of light that acts like a particle, the photon. It also has a wave property. The wave nature of light leads to a condition called diffraction, and due to diffraction, limits are set on resolution. To better understand how that works, we need to explore another concept, which is called numerical aperture.

Vor dem Kauf gilt es also zu prüfen, welche Brennweite den persönlichen Vorlieben oder den häufigsten Einsatzsituationen am meisten entgegenkommt. Klassischerweise werden Makro-Objektive meistens mit mittleren Brennweiten angeboten. Beginnend von 50mm, über 70mm und 90mm bis hinauf zu 105mm. Daneben lassen sich aber auch Modelle mit etwas unüblicheren Brennweiten erwerben. Venus Optics bietet mit dem Laowa 15mm F4 Macro 1:1 beispielsweise ein Makro-Objektiv mit sehr kurzer Brennweite an, von Canon und Sigma lässt sich jeweils ein Telemakro mit 180mm erstehen. Abhängig vom Aufnahmezweck können diese ansprechende und einzigartige Bilder ermöglichen.

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In this video, we will explain key optical imaging formulas and how they help in designing your automated digital microscopy imaging applications. Download Microscopy Calculator

For 20X magnification, which can be a numerical aperture of 0.6 to 0.8, the depth of field drops to about plus or minus 500 nanometers. Moving into high magnification with oil immersion at a numerical aperture of 1.47, the depth of field drops very dramatically, And the depth of field could be plus or minus 0.1 to 0.2 microns (100 – 200 nm). That’s a very tight tolerance. At 100 nanometers or 200 nanometers, very tiny changes in flatness of the sample or the height of the sample, or the precision of the guideways of the XY sample motion stage, will make it tricky to stay in focus. For maintaining focus in this situation, a continuous tracking laser auto-focus system connected to a high bandwidth objective focusing stage, such as the DOF-5, is the ideal way to maintain focus in these high numerical aperture, high-resolution applications.

Wer nur sehr selten kleine Objekte fotografieren möchte oder kein Budget für ein extra Makro-Objektiv hat, kann sich mit verschiedenen Zubehörprodukten behelfen. Dazu gehören Nahlinsen, Zwischenringe oder auch Retro-Adapter. Ohne Nachteile (z. B. muss oftmals eine schlechtere Bildqualität akzeptiert werden) sind diese allerdings nicht zu verwenden.

where Sensor Diagonal is the diagonal size of the camera sensor in millimeters (similar to specifying a TV size), and Objective Magnification is the magnification of the objective lens being used.

Fotografen des aktuellen Zeitalters sind Komfort gewöhnt. Eine hohe Detailschärfe, wenige Abbildungsfehler, ein schneller Autofokus und die optische Bildstabilisierung haben mittlerweile viele Objektive zu bieten. Darauf wollen die meisten natürlich ungern verzichten. Makrofotografen benötigen allerdings nicht zwingend die neuesten Objektivfeatures, in vielen Fällen können sie darauf verzichten. Gerade bei sehr kleinen Objekten kommt man am manuellen Fokussieren kaum vorbei, ein Autofokusmotor wird daher oftmals nicht benötigt. Auf einen optischen Bildstabilisator lässt sich in der Regel ebenso verzichten, ein Stativ ist bei vielen Makrofotos nämlich Pflicht. Gerade wer Geld sparen möchte, kann daher zu Objektiven greifen, die aus heutiger Sicht nicht dem aktuellsten Standard entsprechen. Völlig sinnlos sind ein schneller Autofokus und ein Bildstabilisator allerdings auch nicht, bei der Arbeit aus der Hand sorgen sie für eine deutlich höhere „Trefferquote“. Es ist daher letztendlich eine Frage der gewünschten „Aufnahmeart“, welche Features ein Objektiv besitzen sollte.

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In most cases the material between the objective and sample is air, and “n” equals 1.00. For water, it’s refractive index is 1.33, and specialized immersion oil for microscopy is 1.52. For a low magnification objective such as a 4X or even a 10X, the typical depth of field is plus or minus 3 to 5 microns. In that case, if the sample is very flat, focusing may not be required at all, or only one needs to happen one time. Generally speaking, samples vary in thickness and they vary in flatness, so focusing is required.

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Microscope calculations are specific to the imaging sensor and microscope objective selection, which also impacts the performance requirements of the sample XY motion and Z focusing motion.

Während eine große Blendenöffnung bei vielen Aufnahmen für Vorteile sorgt, ist sie bei Makrofotos oftmals weniger wichtig. Makro-Objektive besitzen daher in der Regel keine überdurchschnittlich große Öffnung, F2.8 sind eine klassische Lichtstärke dieses Objektivstyps. Das liegt nicht unbedingt daran, dass Makrofotografen „freiwillig“ eine kleine Blende verwenden, sondern an der bereits angesprochenen Schärfentiefe. Bei Aufnahmen mit starker Vergrößerung, also zum Beispiel mit einem Abbildungsmaßstab von 1:1, fällt die Schärfentiefe bei F2.8 sehr gering aus. Oftmals müssen Fotografen daher eine Blende von F8, F11 oder sogar F16 verwenden, um ein Motiv oder zumindest den gewünschten Bereich (wie den Kopf) komplett scharf abbilden zu können. Eine große Blende spielt daher meistens nur eine Rolle, wenn das Makro-Objektiv auch andere Aufgaben übernehmen soll. Ein Modell mit 85mm lässt sich beispielsweise für Porträtaufnahmen verwenden.

In the previous example we considered a sensor with 4 micron pixels used with an objective with 40X magnification and a numerical aperture of 0.8. The sensor and magnification provide 100 nm geometric resolution. However, due to diffraction, the sample image resolution will be greater than 100 nm. For example, yellow green light has a wavelength lambda of 550 nm. Using the above equation, the diffraction limited resolution is actually 419 nm. Therefore, the resolution of the sample is > 4 times the geometric resolution at the camera sensor which results in oversampling. While some oversampling is appropriate, 4 times is excessive and a waste of sensor pixels. Calculate the diffraction using our calculator.

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Aufnahmen mit einem Abbildungsmaßstab von 1:1 oder 2:1 sind in der Regel schon sehr ansprechend und erlauben starke Vergrößerungen. Das Ende der Makrofotografie sind sie aber noch lange nicht. Wer sehr kleine Motive extrem stark vergrößern möchte, kann die sogenannten Lupenobjektive erwerben. Diese bieten unter anderem Canon (MP-E 65mm F2.8 1-5x) oder Venus Optics (Laowa 25mm F2.8 2.5-5X Ultra Macro) an. Lupenobjektive sind für extreme Aufnahmen optimiert, abseits der Makrofotografie lassen sie sich nicht verwenden. Das liegt an den stark eingeschränkten Fokussierbereichen, auf unendlich lässt sich nicht scharfstellen. Des Weiteren verfügen Lupenobjetive über keinen Autofokus.

In addition to affecting the observation of the specimen itself, the field of view can also impact the ability to capture high-quality images and videos. A larger field of view requires a larger camera sensor or eyepiece, which can increase the cost of the microscope system. It is essential to consider the balance between field of view, magnification, and cost when selecting and optimizing a microscope for a particular application.

To better understand diffraction imagine if light moved strictly in straight lines. If a pinhole is illuminated with some light, the light would be directed in a straight beam. What actually happens is due to the wave nature of light, the light is diffracted, and instead of going straight, it spreads out into a cone. As shown in the diffraction image, the brightest light is the zero-order straight through, then the intensity decreases for the first order, second order, third order, etc. Unless the objective is capturing all of those higher orders, it is difficult to synthesize a high-resolution image. This describes what the fine structure of your sample is doing, it could be cells, chromosomes, or nuclei, and all of that fine structure spreads the light out.

Die Brennweite hat keinen Einfluss darauf, wie groß sich ein Motiv abbilden lässt. Anders sieht es beim „Bildlook“ aus. Dieser wird von der Brennweite maßgeblich bestimmt. Wie für alle Objektive gilt auch für Makro-Objektive, dass beispielsweise ein Modell mit 35mm zu den Weitwinkelobjektiven gehört und ein Modell mit 105mm zu den Teleobjektiven. Bei kurzen Brennweiten fällt die Schärfentiefe vergleichsweise groß aus, bei längeren Brennweiten ist sie kleiner. Abhängig vom Motiv und den Wünschen des Fotografen sind mal längere Brennweiten und mal kürzere Brennweiten von Vorteil. Dies lässt sich nicht pauschalisieren. Wer sehr starke Vergrößerungen bevorzugt und dabei keine besonderen Techniken zum Vergrößern der Schärfentiefe („Fokus Stacking“) verwenden möchte, sollte eher auf kürzere Brennweiten setzen.

Besonders wichtig ist die Brennweite zudem, da sie den Abstand (= Naheinstellgrenze) des Motivs vom Sensor bestimmt. Objektive mit langen Brennweiten müssen für einen gleichen Abbildungsmaßstab nicht so nah an das Motiv heran wie Objektive mit kürzeren Brennweiten.

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The consequence of numerical aperture is that it directly relates to the Depth Of Field (DOF). For a given objective, looking at a sample, there’s a particular plane of perfect focus. The depth of field is, how far above and below that plane the objective and sample can be and still have everything in focus.

This is called the depth of field. The formula for the depth of field is: where: “n” is the refractive index of the material between the objective and the sample λ (lambda) is the wavelength of light NA is the Numerical Aperture

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Alle genannten Brennweiten gelten wie üblich für Kameras mit Kleinbild Sensoren, in folgender Tabelle haben wir verschiedene Werte entsprechend umgerechnet.

To optimize the field of view for a particular application, it is vital to consider the size of the specimen and the level of detail required. For example, if a large sample with low detail is being observed, a lower magnification and larger field of view may be more appropriate. Conversely, if a smaller specimen with high detail is being observed, a higher magnification and smaller field of view may be necessary to achieve the desired level of resolution.

Laowa 10mm F2.8 Zero-D FF Sigma 15mm F1.4 DG DN Diagonal Fisheye Art Sigma 500mm F5.6 DG DN OS Sports Panasonic Lumix S 28-200mm F4-7.1 Macro O.I.S. Sony FE 24-50mm F2.8 G OM System M.Zuiko Digital ED 150-600mm F5.0‑6.3 IS Sigma 70-200mm F2.8 DG DN Sports Sigma 10-18mm F2.8 DC DN Contemporary Nikkor Z 135mm F1.8 S Plena Panasonic Leica DG Vario 35-100mm F2.8 Power O.I.S Panasonic Leica DG Vario-Elmar 100-400mm F4-6.3 II Asph. Power O.I.S. Sony FE 16-35mm F2.8 GM II TTArtisan 100mm F2.8 Bubble Bokeh Sony FE 70-200mm F4 G OSS II Nikkor Z 70-180mm F2.8 Nikkor Z 180-600mm F5.6-6.3 VR Irix 15mm F2.4 Dragonfly Irix 150mm F2.8 1:1 Macro Dragonfly Sigma 14mm F1.4 DG DN Art Nikkor Z DX 24mm F1.7 AstrHori 18mm F8 2X Makro TTArtisan 100mm F2.8 Macro 2X Tilt-Shift Fujinon XF 8mm F3.5 R WR Canon RF 28mm F2.8 STM Tamron 11-20 mm F2.8 Di III-A RXD Canon RF 100-300mm F2.8L IS USM Nikkor Z DX 12-28mm F3.5-5.6 PZ VR 7Artisans 15mm F4 Samyang AF 35-150mm F2-2.8 FE Sigma 17mm F4 DG DN Contemporary Sigma 50mm F2 DG DN Contemporary Sigma 23mm F1.4 DC DN Contemporary Laowa Argus 28mm F1.2 FF Samyang AF 75mm F1.8 X OM System M.Zuiko Digital ED 90mm F3.5 Macro IS PRO Sigma 50mm F1.4 DG DN Art Nikkor Z 85mm F1.2 S Nikkor Z 26mm F2.8 Viltrox AF 75mm F1.2 XF Pro Sony FE 20-70mm F4 G Sigma 60-600mm F4.5-6.3 DG DN OS Sports Panasonic Lumix S 14-28mm F4-5.6 Macro Venus Optics Laowa 6mm F2 Zero-D MFT Panasonic Leica DG Vario-Elmarit 12-35mm F2.8 Asph. Nikkor Z 40mm F2 SE Fujinon XF 30mm F2.8 R LM WR Macro Nikkor Z 600mm F4 TC VR S Canon RF 135mm F1.8 L IS USM Nikkor Z 17-28mm F2.8 Fujifilm XF56mm F1.2 R WR

Je größer der Abbildungsmaßstab ausfällt, desto größer lassen sich keine Motive abbilden. Während herkömmliche Objektive auf Abbildungsmaßstäbe von etwa 1:5 bis 1:10 kommen, erreichen für Nahaufnahmen optimierte Modelle bis etwa 1:3. Damit meinen wir vor allem Standardzooms oder Teleobjektive, die mit zusätzlichen Makrofunktionen werben. Von „echten“ Makro-Objektivem spricht man dagegen in aller Regel erst ab einem Abbildungsmaßstab von 1:1. Hier greifen die Hersteller auf optimierte Konstruktionen für Makroaufnahmen zurück. Es gibt jedoch auch Makro-Objektive, die speziell für Aufnahmen aus kurzer Distanz optimiert wurden, und „nur“ einen Abbildungsmaßstab von 1:2 besitzen. Die Grenzen sind also durchaus fließend.

The microscope field of view stands for the area of the sample visible through the microscope, which is calculated by dividing the sensor diagonal size by the magnification of the objective lens. For instance, a 20 mm diagonal sensor with a 20X objective lens would yield a Field Of View (FOV) of 1 mm, typical for microscopy applications. Microscope field of view can be calculated using the following formula:

When designing automated digital microscopy devices for life science, biomedical, and diagnostic applications, typically, our goal is to optimize the device for the highest resolution image and the highest throughput in images per second. Microscope calculations such as magnification, resolution, microscope field of view, depth of field, and numerical aperture help us determine various aspects of a microscope’s capabilities and simplify the modeling and prototyping process. In this article, we will cover the importance of microscope calculations in optimizing microscope performance for your specific application.

Bei manchen Motiven mag die Naheinstellgrenze keine Rolle spielen, in vielen Situationen ist sie jedoch von zentraler Bedeutung. Zum Beispiel bei der Aufnahme von lebenden Tieren. Diese lassen sich meistens nicht besonders gern fotografieren und flüchten, sobald man sich mit der Kamera näher. Bekannt ist dieser Abstand unter dem Begriff „Fluchtdistanz“. Unterhalb der Fluchtdistanz werden Aufnahmen schwierig oder unmöglich. Beträgt die Fluchtdistanz beispielsweise 25cm, wären Aufnahmen laut unseres gerade erwähnten Beispiels mit einem 70mm-Objektiv oder 100mm-Objektiv möglich. Die Fluchtdistanz ist natürlich kein fester Wert und kann abhängig vom Fotografen und dessen Auftreten oder auch vom Tier selbst abhängen. Grundsätzlich gilt daher: Beim Fotografieren lebender Tiere sind längere Brennweiten dank des größeren Abstands sinnvoll.

Irgendwann dürfte fast jeder Fotograf einmal in die Lage gekommen sein, ein besonders kleines Motiv ablichten zu wollen. Wer ein kleines Motiv fotografieren möchte, wird dabei natürlich zunächst einmal die offensichtlichste Lösung wählen: Näher ran mit der Kamera bzw. dem Objektiv. Je nach Modell ist hier früher oder später Schluss, den Abstand zum Objekt kann man nicht beliebig verkürzen. Gerade bei „klassischen“ Objektiven wie Standardzooms oder lichtstarken Festbrennweiten hält sich die „Vergrößerungsleistung“ in Grenzen. Wirklich kleine Motive lassen sich damit in aller Regel nicht bildfüllend abbilden. In folgendem Artikel wollen wir auf die Grundlagen der Makrofotografie eingehen und passende Objektive vorstellen.

The image below shows a variety of microscope systems. There are multiple magnification objectives depicted: low power 4x, medium power, 40x and high power 100x. The distance from the end of the objective to the sample, which is called the working distance, is going to be larger on a low power objective, less on a medium power and very fine, possibly a fraction of a millimeter for the high power system. What’s critical is the angle. The sample is illuminated and light is coming out of it. In the case of the shorter working distance, higher numerical aperture objectives, that light is coming at an increasingly higher angle. The Numerical Aperture (NA) of the objective equals the sine of the half-angle (theta divided by two where theta is the entire angle). Read more on how to calculate the numerical aperture.

Wer nicht genau weiß, welche Motive er mit einem Makro-Objektiv hauptsächlich ablichten will, sollte unserer Meinung nach zu einem Modell mit mittlerer Brennweite, also zum Beispiel 90mm, greifen. Damit lässt sich im Fotoalltag gut auskommen. Preislich gehen diese Modelle zudem noch nicht allzu sehr ins Geld. Objektive mit 150mm oder 180mm kosten in der Regel deutlich mehr.