Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.

Die in Abbildung 1 dargestellten Okulare sind mit UW beschriftet (Abkürzung für Ultraweitfeld). Je nach Hersteller sind Okulare häufig auch mit der Bezeichnung H für hohe Einblickhöhe versehen, d. h. der Mikroskopiker kann bei der Betrachtung von Präparaten eine Brille tragen.

Nikon offers a range of super-resolution systems for high-speed imaging applications and single-molecule level imaging needs.

Die vom Okular ausgehenden Lichtstrahlen kreuzen sich an der Austrittspupille oder der Einblickhöhe, die oft als Ramsden-Scheibebezeichnet wird. Dort sollte sich die Pupille des Auges beim Mikroskopieren befinden, um das gesamte Sichtfeld zu sehen (normalerweise 8–10 mm von der Augenlinse entfernt). Durch die höhere Vergrößerung des Okulars befindet sich die Einblickhöhe näher an die Oberseite der Augenlinse, was die Bedienung des Mikroskops erschwert, insbesondere für Brillenträger.

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Kompensationsokulare können positiv oder negativ sein und müssen bei allen Vergrößerungen mit Fluorit-, apochromatischen und allen Varianten von Plan-Objektiven verwendet werden (sie können auch mit Achromaten von 40X und höher verwendet werden). In den letzten Jahren erfolgte bei modernen Mikroskopobjektiven die Korrektur der chromatischen Vergrößerungsabweichung entweder in den Objektiven selbst (z. B. bei den Olympus-Objektiven) oder in der Tubuslinse.

Für hochgenaue Messungen wird ein Filarmikrometer (ähnlich dem in Abbildung 6 dargestellten) verwendet. Dieses Mikrometer ersetzt das herkömmliche Okular und besitzt mehrere Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Strichplatten. Beim Filarmikrometer werden eine Strichplatte mit einer Messskala (es gibt viele verschiedene Skalentypen) und ein sehr feiner Draht mit dem Präparat in den Fokus gebracht (siehe Abbildung 6 (b)). Der Draht ist so angebracht, dass er mit der kalibrierten Rändelschraube an der Seite des Mikrometers langsam über das Sichtfeld bewegt werden kann (siehe Abbildung 6 (a)). Eine vollständige Umdrehung der Rändelschraube (unterteilt in 100 gleiche Teilungen) entspricht dem Abstand zwischen zwei benachbarten Strichplattenmarken. Indem der Draht langsam von einer Position auf dem Präparatbild zu einer anderen bewegt wird und die Änderungen der Rändelschraubenzahlen notiert werden, erhält man eine viel genauere Messung des Abstands. Filarmikrometer (und andere einfache Strichplatten) müssen für jedes Objektiv, mit dem sie verwendet werden, mit einem Tischmikrometer kalibriert werden.

One of the important points to remember about the optical microscope is that the detection optical transfer function has a characteristic frequency that serves as a resolution "cut-off" border (the Abbe limiting frequency; see Figure 3(b)). Frequencies higher than the limiting value are not present in the image recorded by the microscope. The peak-to-peak distance for the highest spatial frequency able to pass through the objective (the value d for the green waveform in Figure 3(a)) is therefore commonly referred to as the Abbe limit, which is more formally defined as the smallest periodicity in a structure that can be detected in the final image. Due to the fact that a point source emits or transmits a wide range of spatial frequencies, the Abbe limit must also be present in the point-spread function spanning three dimensions.

Okulare können für Messzwecke angepasst werden, indem in der Ebene der Okularfeldblende eine kleine kreisförmige Glasplatte (manchmal auch als Skalierung oder Strichplatte bezeichnet) angebracht wird. Strichplatten haben in der Regel Markierungen, z. B. ein Maßlineal oder Raster, die in die Oberfläche geätzt sind. Da die Strichplatte in derselben Ebene wie die Feldblende liegt, erscheint sie scharf und überlagert das Bild des Präparats. Okulare mit Strichplatten müssen einen Fokussiermechanismus enthalten (in der Regel einen Schneckentrieb oder Schieber), mit dem das Bild der Strichplatte scharf gestellt werden kann. Mehrere typische Strichplatten sind in Abbildung 5 unten dargestellt.

Microscope Eyepieceand Objective lens

The process of diffraction involves the spreading of light waves when they interact with the intricate structures that compose a typical specimen. Due to the fact that most specimens observed in the microscope are composed of highly overlapping features that are best represented by multiple point sources of light, discussions of the microscope diffraction barrier center on describing the passage of wavefronts representing a single point source of light through the various optical elements and aperture diaphragms. As will be discussed below, the transmitted light or fluorescence emission wavefronts emanating from a point in the specimen plane of the microscope become diffracted at the edges of the objective aperture, effectively spreading the wavefronts to produce an image of the point source that is broadened into a diffraction pattern having a central disk of finite, but larger size than the original point. Therefore, due to diffraction of light, the image of a specimen never perfectly represents the real details present in the specimen because there is a lower limit below which the microscope optical system cannot resolve structural details.

Bei der Auswahl eines Okulars spielen viele Faktoren eine Rolle. Wichtig ist, dass Okular und Objektiv kompatibel sind. Wir empfehlen, zuerst das Objektiv sorgfältig auszuwählen und dann ein Okular zu beschaffen, das für dieses Objektiv geeignet ist.

EyepieceTube

In ihrer einfachsten Form sind sowohl die Augen- als auch die Feldlinse plan-konvex, d. h. die konvexen Seiten sind dem Objekt zugewandt. Etwa in der Mitte zwischen diesen Linsen befindet sich eine feste kreisförmige Öffnung oder eine innere Blende. Die Größe der Blende bestimmt das kreisförmige Sichtfeld beim Blick in das Mikroskop.

Die Eigenschaften verschiedener handelsüblicher Okulare (hergestellt von Olympus) sind in Tabelle 1 nach Art sortiert aufgeführt. Die drei in Tabelle 1 aufgeführten Hauptarten von Okularen sind Sucher, Weitwinkelund Superweitwinkel.

Kamerasysteme sind zu einem festen Bestandteil von Mikroskopen geworden, und die meisten Hersteller bieten Kameras für mikrofotografische Zwecke als optionales Zubehör an. Diese modernen Kamerasysteme sind häufig mit motorgesteuerten Blackboxes ausgestattet, die den Film speichern und bei Mikroaufnahmen automatisch jedes Einzelbild aufnehmen.

As described above, the intensity distribution of an Airy disk in three dimensions is referred to as a point-spread function and completely describes the diffraction pattern of a point source of light (such as a single fluorophore) in the lateral (x,y) and axial (z) dimensions as modified by a diffraction-limited optical microscope. The size of the point spread function is determined by the wavelength of imaging light and the characteristics of the objective (numerical aperture) and the refractive index of the imaging medium. Resolution, in a practical sense, is often defined as the smallest separation distance between two point-like objects in which they can still be distinguished as individual emitters (and not amalgamated into a single spot). As a result, most resolution criteria (for example, the Rayleigh criterion, Sparrow limit, or the full width at half maximum; FWHM) are directly related to the properties and geometry of the point-spread function.

According to Abbe's theory, images are composed from an array of diffraction-limited spots having varying intensity that overlap to produce the final result, as described above. Thus, the only mechanism for optimizing spatial resolution and image contrast is to minimize the size of the diffraction-limited spots by decreasing the imaging wavelength, increasing numerical aperture, or using an imaging medium having a larger refractive index. However, under ideal conditions with the most powerful objectives, lateral resolution is still limited to relatively modest levels approaching 200 to 250 nanometers (see Equation (1)) due to transmission characterics of glass at wavelengths beneath 400 nanometers and the physical constraints on numerical aperture. In contrast, the axial dimension of the Airy disk forms an elliptical pattern that often referred to as the point-spread function (PSF). The elongated geometry of the point-spread function along the optical axis arises from the nature of the non-symmetrical wavefront that emerges from the microscope objective. Axial resolution in optical microscopy is even worse than lateral resolution (as outlined in Equation (2)), on the order of 500 nanometers. When attempting to image highly convoluted features, such as cellular organelles, diffraction-limited resolution is manifested as poor axial sectioning capability and lowered contrast in the imaging plane. Furthermore, overall specimen contrast achieved in three-dimensional specimens is generally dominated by the relatively poor axial resolution that occurs due to out-of-focus light interference with the point-spread function.

Both interference and diffraction, which are actually manifestations of the same process, are responsible for creating a real image of the specimen at the intermediate image plane in a microscope. In brief, interference between two wavefronts occurs with addition to double the amplitude if the waves are perfectly in phase (constructive interference), but the waves cancel each other completely when out of phase by 180 degrees (termed destructiveinterference; however, most interference occurs somewhere in between). The photon energy inherent in a light wave is not itself doubled or annihilated when two waves interfere; rather this energy is channeled during diffraction and interference in directions that permit constructive interference. Therefore, interference and diffraction should be considered as phenomena involving the redistribution of light waves and photon energy.

Die andere Hauptart eines einfachen Okulars ist das positive Okular mit einer Blende unter den Linsen, allgemein bezeichnet als Ramsden-Okular, wie in Abbildung 2 links. Dieses Okular hat eine Augenlinse und eine Feldlinse, die ebenfalls plankonvex sind, aber die Feldlinse ist so montiert, dass die gekrümmte Oberfläche zur Augenlinse zeigt. Die vordere Brennebene dieses Okulars liegt direkt unter der Feldlinse auf Höhe der Okularblende, so dass dieses Okular gut zur Montage von Strichplatten geeignet ist. Um eine bessere Korrektur zu erreichen, können die beiden Linsen des Ramsden-Okulars verkittet werden.

The resolution limits imposed by the physical laws that govern optical microscopy can be exceeded, however, by taking advantage of "loopholes" in the law that underscore the fact that the limitations are true only under certain assumptions. Techniques exploiting these "loopholes" have come to be known as super-resolution microscopies, with many major manufacturers now offering various types of super-resolution microscopes.

Eyepiecelens

Eine modifizierte Version des einfachen Huygens-Okulars ist in Abbildung 3 rechts dargestellt. Diese modifizierten Okulare sind zwar leistungsfähiger als ihre einfachen Gegenstücke mit einer Linse, eignen sich jedoch nur für Achromate mit geringer Leistung.

In addition to the diffraction phenomenon that occurs with divergent light waves in optical instruments, the process of interference describes the recombination and summation of two or more superimposed wavefronts. Interference of light is perhaps the most ubiquitous phenomenon in optical microscopy and plays a central role in all aspects of image formation. In fluorescence or laser scanning confocal microscopy, the role of the objective is to focus the excitation light onto a focal point in order to ensure constructive interference of the focused wavefront at the specimen plane. In terms of this requirement, constructive interference (discussed below) ensures that the electric field vector of wavefronts incident from all available objective aperture angles resides in the same phase and therefore produces the smallest possible excitation spot.

Wählen Sie die Okular-Objektiv-Kombinationen sorgfältig aus, um die optimale Vergrößerung des Objekts zu gewährleisten, ohne unnötige Artefakte zu erzeugen. Um beispielsweise eine 250X-Vergrößerung zu erreichen, könnte man ein 25X-Okular mit einem 10X-Objektiv wählen. Eine andere Möglichkeit für dieselbe Vergrößerung wäre ein 10X-Okular mit einem 25X-Objektiv. Da das 25X-Objektiv eine höhere numerische Apertur (ca. 0,65 NA) hat als das 10X-Objektiv (ca. 0,25 NA) und die Werte der numerischen Apertur die Auflösung eines Objektivs bestimmen, ist letztere Wahl ideal. Bei Mikroaufnahmen desselben Sichtfeldes mit jeder der oben beschriebenen Objektiv/Okular-Kombinationen würde die Kombination aus 10X-Okular/25X-Objektiv Mikroaufnahmen liefern, die im Vergleich zu den anderen Kombinationen eine überragende Detailgenauigkeit und Klarheit der Präparate hätten.

where λ is the average wavelength of illumination in transmitted light or the excitation wavelength band in fluorescence. The objective numerical aperture (NA = n•sin(θ)) is defined by the refractive index of the imaging medium (n; usually air, water, glycerin, or oil) multiplied by the sine of the aperture angle (sin(θ)). As a result of this relationship, the size of the spot created by a point source decreases with decreasing wavelength and increasing numerical aperture, but always remains a disk of finite diameter. Thus, the image spot size produced by a 100x magnification objective having a numerical aperture of 0.90 in green light (550 nanometers) is approximately 300 nanometers, whereas the spot size produced by a 100x objective of numerical aperture 1.4 is approximately 200 nanometers. The diffraction-limited resolution theory was advanced by German physicist Ernst Abbe in 1873 (see Equation (1)) and later refined by Lord Rayleigh in 1896 (Equation (3)) to quantitate the measure of separation necessary between two Airy patterns in order to distinguish them as separate entities.

Laser scanning confocal and multiphoton microscopy have been widely used to moderately enhance spatial resolution along both the lateral and axial axes, but the techniques remain limited in terms of achieving substantial improvement. The focused laser excitation coupled with pinhole-restricted detection in confocal microscopy can, in principle, improve the spatial resolution by a factor of 1.4, although this is only realized at a significant cost in signal-to-noise. Likewise, multiphoton fluorescence microscopy takes advantage of nonlinear absorption processes to reduce the effective size of the excitation point-spread function. Once again, however, the smaller and more refined point-spread function is counteracted by the necessity to use longer wavelength excitation light. As a result, rather than providing dramatic improvements to resolution, the primary advantage of confocal and multiphoton microscopy over traditional widefield techniques is the reduction of background signal originating from emission sources removed from the focal plane (out-of-focus light), which enables crisp optical sections to be obtained for three-dimensional volume-rendered imaging.

Einige Okulare haben einen beweglichen Zeiger, der sich im Okular befindet und so platziert ist, dass er als Silhouette in der Bildebene erscheint. Dieser Zeiger eignet sich, um auf bestimmte Merkmale eines Präparats hinzuweisen, insbesondere zu Lehr- und Demonstrationszwecken Die meisten Okularzeiger können in einem Winkel von 360° um das Objekt gedreht werden; modernere Versionen lassen sich über das gesamte Sichtfeld verschieben.

According to the Rayleigh criterion, two point sources observed in the microscope are regarded as being resolved when the principal diffraction maximum (the central spot of the Airy disk; see Figure 2) from one of the point sources overlaps with the first minimum (dark region surrounding the central spot) of the Airy disk from the other point source. If the distance between the two Airy disks or point-spread functions is greater than this value, the two point sources are considered to be resolved (and can readily be distinguished). Otherwise, the Airy disks merge together and are considered not to be resolved. Stated in other terms, the Rayleigh criterion is satisfied when the distance between the images of two closely spaced point sources is approximately equal to the width of the point-spread function. In contrast, the Sparrow resolution limit is defined as the distance between two point sources where the images no longer have a dip in brightness between the central peaks, but rather exhibit constant brightness across the region between the peaks. The Sparrow resolution limit is closer to the Abbe value and approximately two-thirds (Equation (4)) of the Rayleigh resolution limit.

What isthe function ofeyepieceinmicroscope

Häufig werden spezielle Okulare für die Mikrofotografie hergestellt, die als Fotookulare bezeichnet werden. Diese Okulare sind in der Regel negative (Huygens-) Okulare und können nicht für virtuelle Bilder verwendet werden. Aus diesem Grund werden sie üblicherweise als Projektionsobjektive bezeichnet. Ein typisches Projektionsobjektiv ist in Abbildung 7 unten dargestellt.

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Das Okular ist der Teil des Mikroskops, der das vom Objektiv des Mikroskops erzeugte Bild so vergrößert, dass es vom menschlichen Auge gesehen werden kann. In diesem Handbuch befassen wir uns mit den verschiedenen Arten von Okularen, ihren Bestandteilen, ihrer Funktionsweise und ihrer Verwendung.

Um die besten Ergebnisse in der Mikroskopie zu erzielen, sollten Objektive mit Okularen kombiniert werden, die für die jeweilige Korrektur und den Objektivtyp geeignet sind. Der grundlegende Aufbau eines typischen modernen Okulars ist in Abbildung 1 unten dargestellt. Die Beschriftungen an der Seite des Okulars geben die Eigenschaften und Funktionen an.

Moderne Mikroskope verfügen über stark verbesserte plankorrigierte Objektive, bei denen das Primärbild eine viel geringere Feldkrümmung aufweist als bei älteren Objektiven. Darüber hinaus besitzen die meisten Mikroskope heute viel breitere Gehäusetuben und dadurch deutlich größere Zwischenbilder.

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Die von den verschiedenen Herstellern verwendete Terminologie kann verwirrend sein. Achten Sie daher genau auf die Angaben in Broschüren und Mikroskophandbüchern, um die richtigen Okulare für ein bestimmtes Objektiv auszuwählen.

Der Begriff „Okularlinse“ kann sich auf das Okular als Ganzes oder speziell auf die Augenlinse – die Linse, die dem Auge am nächsten ist – beziehen.

Okulare vergrößern in Kombination mit Mikroskopobjektiven das Zwischenbild nochmals, so dass das Objekt im Detail betrachtet werden kann. Okularlinsen ist eine alternative Bezeichnung für Okulare. Aus Gründen der Einheitlichkeit werden in dieser Erläuterung alle Okulare und Okularlinsen als Okulare bezeichnet.

Früher waren Okulare in einem breiten Spektrum von Vergrößerungen von 6,3X bis 25X erhältlich, für spezielle Anwendungen manchmal sogar mit noch höheren Vergrößerungen. Diese Okulare sind sehr nützlich für die Beobachtung und Mikrofotografie mit Objektiven geringer Leistung. Leider tritt bei Objektiven mit höherer Leistung das Problem der leeren Vergrößerung auf, wenn man Okulare mit sehr hoher Vergrößerung verwendet, diese sollten daher vermieden werden. Heute beschränken sich die meisten Hersteller auf Okulare im Bereich von 10x bis 20x. Der Durchmesser des Sehfelds in einem Okular wird als Sehfeldzahl oder Feldzahl angegeben (FN). Aus der Angabe der Sehfeldzahl eines Okulars lässt sich mit folgender Formel der tatsächliche Durchmesser des Objektsuchfelds ermitteln:

Es gibt zwei Hauptarten von Okularen, die nach der Anordnung der Linsen und der Blende unterschieden werden: negative Okulare (oder Huygens-Okulare) mit einer inneren Blende und positive Okulare (oder Ramsden-Okulare) mit einer Blende unter den Linsen des Okulars.

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Kompensationsokulare spielen eine entscheidende Rolle bei der Beseitigung chromatischer Aberrationen, die bei hochkorrigierten Objektiven auftreten. Daher sollten die von einem bestimmten Hersteller entwickelten Ausgleichsokulare möglichst zusammen mit den höher korrigierten Objektiven dieses Herstellers verwendet werden. Die Verwendung eines falschen Okulars mit einem Apochromat, das für eine endliche Tubuslänge (160 oder 170 mm) ausgelegt ist, führt zu einem deutlich erhöhten Kontrast mit roten Streifen an den Außendurchmessern und blauen Streifen an den Innendurchmessern der Präparatdetails. Zusätzliche Probleme ergeben sich aus der begrenzten Ebenheit des Sehfelds bei einfachen Okularen, selbst wenn diese mit Augenlinsendubletten korrigiert sind.

Illustrated in Figure 1 is the effect of objective aperture angle on the size of a diffraction spot produced in a typical optical microscope. The point source and its conjugate (P) in the image plane where wavefronts converge and undergo constructive interference are illustrated for objectives having large (Figure 1(a)) and small (Figure 1(b)) numerical aperture. The point P1is moved laterally in the focal plane until destructive interference at a certain distance (dictated by the objective numerical aperture) defines the location of the first diffraction minimum and thus the radius of the diffraction spot. For the high resolution configuration in Figure 1(a), Points A and B in the wavefront produce a smaller spot size with 10 arbitrary units defining the imaged spot size. In contrast, for the lower resolution configuration presented in Figure 1(b), the reduced aperture angle increases the distance between A and B to 18 arbitrary units. In other words, light emitted by a fluorophore (the point source) is focused by the objective at the image plane where wavefronts traveling the same distance arrive at the image plane in phase and interfere constructively to produce a spot having high intensity. Destructive interference, leading to zero intensity, is generated by wavefronts that arrive one-half wavelength out of phase (see discussion above). Because the drop in intensity is gradual along the lateral axis of the spot, two point sources (or fluorescent molecules) closer together than the size of the spot will appear to be a single, larger spot and are unresolved.

Der Bereich der förderlichen Vergrößerung für eine Objektiv/Okular-Kombination wird durch die numerische Apertur des Systems definiert. Es gibt eine Mindestvergrößerung, um die Details in einem Bild aufzulösen. Dieser Wert ist in der Regel ziemlich willkürlich auf das 500-Fache der numerischen Apertur (500 × NA) festgelegt.

The Abbe equation for resolution avoids the shortcomings of the Rayleigh criterion and Sparrow limit, but with a more indirect interpretation. The process of imaging a specimen in the microscope can be described by a convolution operation between the illumination and fluorescence emission (or transmitted light) point-spread functions. After being subjected to Fourier transformation (see Figure 3), objects observed in the microscope (whether they are periodic or not) can be uniquely described as a summation of numerous sinusoidal curves having different spatial frequencies. Note that the image of a specimen, present in all conjugate image planes, exists as the Fourier transform in the corresponding aperture planes where higher frequencies represent fine specimen detail and lower frequencies represent coarse details (Figure 3(a)). This point is illustrated with the waveform in objective rear aperture in Figure 3(b). The lower spatial frequencies reside near the center of the aperture, while the frequency progressively increases for regions approaching the edges of the aperture.

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Das einfachste negative Okular, das oft als Huygens-Okular bezeichnet wird (siehe Abbildung 2), ist bei den meisten Lehr- und Labormikroskopen mit Achromaten zu finden. Obwohl das Huygens-Okular und die Feldlinsen nicht gut korrigiert sind, heben sich ihre Aberrationen in der Regel gegenseitig auf. Stärker korrigierte negative Okulare bestehen aus zwei oder drei Linsenelementen, die zu einer Augenlinse verkittet sind. Wenn bei einem unbekannten Okular nur die Vergrößerung auf dem Gehäuse angegeben ist, handelt es sich höchstwahrscheinlich um ein Huygens-Okular, das sich am besten für Achromate mit 5X bis 40X Vergrößerung eignet.

In Tabelle 1 sind die Abkürzungen für Weitwinkel- und Superweitwinkelokulare an ihre Korrektur für hohe Einblickhöhe gekoppelt und lauten WH bzw. SWH. Die Vergrößerungen sind entweder 10X oder 15X, die Feldzahlen liegen je nach Anwendung bei 14 bis 26,5. Die Dioptrieneinstellung ist bei allen Okularen annähernd gleich, viele besitzen außerdem eine Fotomaske oder eine Mikrometermarke.

Presented in Figure 2 is a graphical representation of the Rayleigh criterion for both the lateral and axial dimensions of two closely positioned point sources. In Figure 2(a), the intensity of the point sources is represented by solid blue and dashed yellow curves. The total intensity generated by the combined point sources is represented by a red curve that is displaced along the ordinate for clarity. In order to distinguish between these point sources, the distance between the peaks should be sufficient to produce an intensity minimum that ranges between 20 and 30 percent of the peak intensity (Figure 2(a)). The same criterion applies to the axial dimension (Figure 2(b)). Note that the resolution (indicated in Figures 2(a) and 2(b) along the abscissa) is significantly lower along the z axis.

Einfache Okulare, wie Huygens- und Ramsden-Okulare, und ihre achromatischen Gegenstücke korrigieren den verbleibenden Farbunterschied der Vergrößerung im Zwischenbild nicht, insbesondere nicht, wenn sie mit Achromaten mit hoher Vergrößerung oder Fluorit- oder apochromatischen Objektiven kombiniert werden. Um dieses Problem zu beheben, gibt es kompensierende Okulare, die einen gleichen, aber entgegengesetzten chromatischen Fehler in die Linsenelemente einbringen.

Kompensationsokulare sind oft mit K, C oder comp sowie der Vergrößerung beschriftet. Okulare, die mit Flachfeldobjektiven verwendet werden, werden mitunter als plankompensiert bezeichnet.

Even in cases where an optical microscope is equipped with the highest available quality of lens elements, is perfectly aligned, and has the highest numerical aperture, the resolution remains limited to approximately half the wavelength of light in the best case scenario. In practice, the resolution typically achieved in routine imaging often does not reach the physical limit imposed by diffraction. This is due to the fact that optical inhomogeneities in the specimen can distort the phase of the excitation beam, leading to a focal volume that is significantly larger than the diffraction-limited idea. Additionally, resolution can also be compromised by the use of incompatible immersion oil, coverslips having a thickness outside the optimum range, and improperly adjusted correction collars.

Das Periplan-Okular, das in Abbildung 4 oben dargestellt ist, ist das Ergebnis der Weiterentwicklung der Konstruktion. Dieses Okular enthält sieben Linsenelemente, die zu einem Dublett, einem Triplett und zwei Einzellinsen verkittet sind. Die konstruktiven Verbesserungen der Periplan-Okulare erlauben eine bessere Korrektur der chromatischen Aberation, verbessern die Bildebenheit und insgesamt die Eigenschaften bei Verwendung hochwertiger Objektive.

Although the Rayleigh criterion and similar measures are useful resolution gauges for observation of the specimen, there remain several shortcomings of such a definition for resolution. For example, in cases where the investigator is aware that two particles are merged to form a single point image, computer algorithms can be applied to discriminate between the particles to arbitrarily smaller distances. Determining the exact position of the two adjacent particles then becomes a question of experimental precision dictated by photon statistics rather than being described by the Rayleigh limit. Furthermore, resolution limits do not necessarily correspond to the level of detail that can be observed in images. While the Rayleigh limit is defined as the distance from the center of the first minimum of the point-spread function, this value can be rendered smaller by advanced optical systems or linear optics. Resolution criteria also do not rely on the fact that light is a diffracting wavefront that poses a finite limit to the level of detail that is actually contained within the waves.

Set up Magnifier through Quick tap · Open your phone's Settings app. · Tap System and then Gestures and then Quick tap. · Turn on Use Quick tap. · Choose Open ...

A traditional widefield microscope generates an image of a point source by capturing the light in various locations in the objective and further processing the wavefronts as the pass through the optical train to finally interfere at the image plane. As a consequence of the reciprocity principle in optics, the Abbe limit in the lateral axis of the microscope corresponds to the maximum-to-maximum distance that can be obtained by interfering two waves at the most extreme angles captured by the objective. The Abbe resolution limit is attractive because it depends only on the maximal relative angle between different wavefronts leaving the specimen and captured by the objective. This limit therefore describes the smallest level of detail that can possibly be imaged, and that periodic structures have higher spatial frequency (shorter wavelengths) will not be transferred to the image.

Body tubemicroscopefunction

A point object in a microscope, such as a fluorescent protein single molecule, generates an image at the intermediate plane that consists of a diffraction pattern created by the action of interference. When highly magnified, the diffraction pattern of the point object is observed to consist of a central spot (diffraction disk) surrounded by a series of diffraction rings (see Figure 1). In the nomenclature associated with diffraction theory, the bright central region is referred to as the zeroth-order diffraction spot while the rings are called the first, second, third, etc., order diffraction rings. When the microscope is properly focused, the intensity of light at the minima between the rings is zero. Combined, this point source diffraction pattern is referred to as an Airy disk (after Sir George B. Airy, a nineteenth century English astronomer). The size of the central spot in the Airy pattern is related to the wavelength of light and the aperture angle of the objective. For a microscope objective, the aperture angle is described by the numerical aperture (NA), which includes the term sin θ, the half angle over which the objective can gather light from the specimen. In terms of resolution, the radius of the diffraction Airy disk in the lateral (x,y) image plane is defined by the following formula:

Wir empfehlen, zuerst das Objektiv sorgfältig auszuwählen und dann ein Okular anzuschaffen, das für dieses Objektiv geeignet ist. Bei der Auswahl von Okularen ist es relativ einfach, zwischen einfachen und stärker kompensierten Okularen zu unterscheiden. Einfache Okulare wie das Ramsden- und das Huygens-Okular (und ihre stärker korrigierten Gegenstücke) weisen einen blauen Ring um den Rand der Okularblende auf, wenn sie durch das Mikroskop betrachtet oder gegen eine Lichtquelle gehalten werden. Im Gegensatz dazu weisen stärker korrigierte Ausgleichsokulare unter den gleichen Bedingungen einen gelb-rot-orangen Ring um die Blende auf.

Um diesen neuen Eigenschaften Rechnung zu tragen, gibt es inzwischen Weitwinkelokulare (siehe Abbildung 1), die den sichtbaren Bereich des Objekts um bis zu 40 Prozent vergrößern. Da die Okular-Objektiv-Korrekturtechniken von Hersteller zu Hersteller unterschiedlich sind, ist es wichtig, nur die von einem bestimmten Hersteller für die Verwendung mit seinen Objektiven empfohlenen Okulare zu verwenden.

Eyepiecemagnification

Die Okularvergrößerung der Okulare in Abbildung 1 beträgt 10X, wie auf dem Gehäuse angegeben. Die Beschriftung A/24 steht für die Feldzahl 24, dies ist der Durchmesser (in Millimetern) der festen Blende im Okular. Diese Okulare verfügen außerdem über einen Fokustrieb und eine Rändelschraube, mit der sie in ihrer Position fixiert werden können. Heutzutage werden häufig Okulare mit Gummiaugenmuscheln hergestellt, die sowohl dazu dienen, die Augen im richtigen Abstand zur Frontlinse zu positionieren als auch verhindern, dass Raumlicht von der Linsenoberfläche reflektiert wird und die Sicht stört.

Diffractive elements are thin phase elements that operate by means of interference and diffraction to produce arbitrary distributions of light or to aid in ...

Projektionsobjektive müssen sorgfältig korrigiert werden, damit sie flache Bilder erzeugen, was für eine genaue Mikrofotografie unabdingbar ist. Sie sind in der Regel auch farbkorrigiert, um eine originalgetreue Wiedergabe der Farben in der Farbmikrofotografie zu gewährleisten. Die Vergrößerungsfaktoren von Projektionsobjektiven für die Mikrofotografie reichen von 1X bis etwa 5X. Diese Linsen können gegeneinander ausgetauscht werden, um die Größe des endgültigen Bildes im Mikroskop anzupassen.

The optical microscope has played a central role in helping to untangle the complex mysteries of biology ever since the seventeenth century when Dutch inventor Antoni van Leeuwenhoek and English scientist Robert Hooke first reported observations using single-lens and compound microscopes, respectively. Over the past three centuries, a vast number of technological developments and manufacturing breakthroughs have led to significantly advanced microscope designs featuring dramatically improved image quality with minimal aberration. However, despite the computer-aided optical design and automated grinding methodology utilized to fabricate modern lens components, glass-based microscopes are still hampered by an ultimate limit in optical resolution that is imposed by the diffraction of visible light wavefronts as they pass through the circular aperture at the rear focal plane of the objective. As a result, the highest achievable point-to-point resolution that can be obtained with an optical microscope is governed by a fundamental set of physical laws that cannot be easily overcome by rational alternations in objective lens or aperture design. These resolution limitations are often referred to as the diffraction barrier, which restricts the ability of optical instruments to distinguish between two objects separated by a lateral distance less than approximately half the wavelength of light used to image the specimen.

Die Strichplatte in Abbildung 5 (a) ist ein übliches Element von Okularen, die zur Einzelbildaufnahme von Sichtfeldern für die Mikrofotografie bestimmt sind. Das kleine rechteckige Element umschließt den Bereich, der mit einem 35-mm-Film aufgenommen werden soll. Andere Filmformate (120 mm und 4 × 5 Zoll) werden durch Gruppen von Ecken innerhalb des größeren 35-mm-Rechtecks abgegrenzt. In der Mitte der Strichplatte befindet sich eine Reihe von Kreisen, die von vier parallelen Linien in einem X-Muster umgeben sind. Mit diesen Linien lassen sich Strichplatte und Bild so fokussieren, dass sie zur Filmebene eines am Mikroskop angebrachten Kamerarückteils parfokal sind. Die Strichplatte in Abbildung 5 (b) ist ein Mikrometerlineal, das zur Messung von Bildabständen verwendet werden kann. Das gekreuzte Mikrometer in Abbildung 5 (c) wird bei Polarisationsmikroskopen verwendet, um die Ausrichtung der Präparate für den Polarisator und den Analysator zu bestimmen. Das in Abbildung 5 (d) dargestellte Raster wird verwendet, um einen Ausschnitt des Sichtfeldes für die Zählung zu unterteilen. Es gibt noch viele andere Varianten von Okularstrichplatten. Erkundigen Sie sich daher bei den Herstellern von Mikroskopen und optischem Zubehör nach den Arten und der Verfügbarkeit dieser nützlichen Messhilfen.

Michael W. Davidson National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310, USA.

Ein gemeinsames Merkmal dieser integrierten Kamerasysteme ist ein Teleskop-Okular mit Strahlenteiler (siehe Abbildung 8), mit dem die Präparate für die Mikrofotografie betrachtet, fokussiert und als Einzelbild aufgenommen werden können. Dieses Teleskop enthält eine Mikrofotografie-Strichplatte ähnlich wie in Abbildung 5 (a), mit einem eingravierten rechteckigen Element, das den mit 35-mm-Film aufgenommenen Bereich umschreibt, sowie Eckhalterungen für Planfilme größeren Formats. Zum leichteren Scannen und Fotografieren von Präparaten kann das Teleskopokular so eingestellt werden, dass es mit den Okularen parfokal ist, um die Einzelbildaufnahme von Mikrofotografien zu erleichtern.

Um dieses Problem auszugleichen, wurden Okulare mit hoher Einblickhöhe entwickelt, die einen Augenabstand von 20–25 mm von der Oberfläche der Augenlinse aufweisen. Diese verbesserten Okulare haben Augenlinsen mit größerem Durchmesser, die mehr optische Elemente enthalten und in der Regel eine bessere Bildebenheit aufweisen. Sie sind oft mit der Aufschrift H auf dem Okulargehäuse gekennzeichnet, entweder allein oder in Kombination mit anderen Abkürzungen.

Eine modifizierte Version des Ramsden-Okulars ist das so genannte Kellner-Okular (links in Abbildung 3). Diese verbesserten Okulare bestehen aus zwei miteinander verkitteten Linsenelementen und haben eine höhere Einblickhöhe als die Ramsden- oder Huygens-Okulare sowie ein viel größeres Sehfeld.

Es sei darauf hingewiesen, dass Okulare mit hoher Einblickhöhe besonders nützlich für Mikroskopiker sind, die zur Korrektur ihrer Kurz- oder Weitsichtigkeit eine Brille tragen, sie korrigieren aber nicht verschiedene andere Sehschwächen, z. B. Astigmatismus. Heutzutage sind Okulare mit hoher Einblickhöhe sehr beliebt, auch bei Menschen, die keine Brille tragen, da der große Augenabstand die Ermüdung verringert und die Betrachtung von Bildern durch das Mikroskop viel angenehmer macht.

Am anderen Ende des Spektrums ist die maximale förderliche Vergrößerung eines Bildes in der Regel auf das 1.000-Fache der numerischen Apertur (1000 × NA) festgelegt. Vergrößerungen über diesem Wert hinaus liefern weder weitere nützliche Informationen noch eine feinere Auflösung von Bilddetails, sondern führen in der Regel zu einer Bildverschlechterung. Wird die Grenze der förderlichen Vergrößerung überschritten, entsteht das Phänomen der leeren Vergrößerung, d. h. eine weitere Vergrößerung durch das Okular oder die Zwischentubuslinse führt zwar zu einer stärkeren Vergrößerung des Bildes, nicht aber zu einer besseren Detailauflösung.

Dabei ist FN die Feldzahl in Millimetern, M(O) die Objektivvergrößerung und M(T) der Vergrößerungsfaktor der Tubuslinse (falls vorhanden). Bei Anwendung dieser Formel auf das in Tabelle 1 aufgeführte Superweitwinkelokular ergibt sich für ein 40X-Objektiv mit einer Tubuslinsenvergrößerung von 1,25 folgende Berechnung: FN = 26,5 / M(O) = 40 × M(T) = 1,25 = Gesichtsfelddurchmesser 0,53 mm. In Tabelle 2 sind die Sehfeldgrößen für die üblichen Objektive aufgeführt, die bei Verwendung dieses Okulars auftreten würden.

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The concept of convolution in real space can be readily simplified by examining the equivalent operation in Fourier space. In the latter, the transformed object can be multiplied with the Fourier transform of the point-spread function to yield the Fourier transform of an ideal image lacking noise. After Fourier transformation, the point-spread function describes how efficiently each spatial frequency of the specimen is transferred to the final image. Thus, the Fourier-transformed point-spread function is referred to as the optical transfer function (OTF; see Figure 3(b)). The OTF defines the extent to which spatial frequencies containing information about the specimen are lost, retained, attenuated, or phase-shifted during the imaging process. Spatial frequency information that is lost during imaging cannot be recovered, so one of the primary goals for all forms of microscopy is to acquire the highest frequency range as possible for the specimen. The value of the OTF at each spatial frequency (measured in oscillations per meter) is a useful indicator to describe the contrast that a particular sinusoidal object feature achieves in the final image.